膜融合是细胞内最重要的生命活动之一。保守的SNARE家族蛋白通过形成高度稳定的SNARE复合体介导膜融合。SNARE复合体必须被解聚成单体以便循环使用，而这依赖于ATP酶NSF蛋白。NSF通过适配蛋白SNAP与SNARE复合体结合形成20S复合体，随后水解ATP产生能量将SNARE复合体解聚。自1998年科学家发现NSF以来，NSF解聚SNARE复合体的工作机制一直是研究热点。虽然已有20S复合体的结构，但由于缺少解聚中间态的信息，SNARE复合体解聚的机制依旧不清楚。

2025年1月2日，清华大学生命科学学院隋森芳课题组与陈春来课题组合作，在《自然通讯》（Nature Communications）杂志发表了题目为“单分子双色和三色FRET研究揭示了NSF解聚SNARE复合体过程中的过渡态（Single-molecule two- and three-colour FRET studies reveal a transition state in SNARE disassembly by NSF）”的研究论文，澄清了SNARE解聚的顺序问题。

研究人员首次利用单分子三色FRET技术在接近生理环境（即膜存在的条件）下监测NSF解聚SNARE复合体的过程，这一实验方案在硬件、生化样品制备和数据处理方面都极具挑战性。通过biotin标记的磷脂组装的纳米盘将SNARE复合体固定在玻片上，组成SNARE复合体的三个蛋白（Syntaxin、Vamp和SNAP25）分别标记上Cy3、Cy5和Cy7荧光染料，基于研究人员的设计，在所有三个FRET对之间都有很高的FRET效率。随后加入NSF、a-SNAP、ATP、Mg2+启动反应，同时使用全内反射显微镜记录荧光信号，根据信号的轨迹获取动态信息（图1）。基于方法上的进步，以及同时捕获三个蛋白运动的精妙实验设计，研究人员能够捕捉到比早先报道更丰富的信息。他们观察到SNARE复合体的解聚存在两条主要路径。一条路径是Syntaxin首先以可观察到的瞬时状态在N端与复合物的其余部分分离，然后完全解离。另一条路径是VAMP首先与Syntaxin和SNAP25解离（图2）。这个实验结果澄清了领域内的一个重要问题，即SNARE复合体的解聚主要是一个依次解离的过程，而不是以前报道的同时解离的方式。

图1. 单分子三色FRET实验流程示意图（a）和典型的荧光轨迹（b和c）

图2. NSF解聚SNARE复合体的两条主要路径示意图

清华大学生命科学学院隋森芳教授、陈春来副教授和孙珊副研究员为本文共同通讯作者。清华大学生命科学学院已出站博士后Sudheer K. Cheppali、2019级博士生李畅、2018级博士生邢文婧（已毕业）为本文共同一作。本项目获得了国家自然科学基金委、国家重点研发计划、北京生物结构前沿研究中心、膜生物学国家重点实验室等的经费资助。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-55531-0