基于相机的单分子荧光共振能量转移（FRET）技术能够精确测量来自单个荧光分子的信号，从而表征和揭示生物大分子的重要动态过程。该技术以其较高的实验通量、优越的技术成熟度成为阐释生物大分子结构变化、反应途径和分子机制的重要生物物理学手段。 然而，现有实验手段从图像中准确识别源自单个分子的荧光信号需要600-700个光子，但荧光分子在光漂白前发出的总光子是有限的，这使得单分子FRET技术的总观测时长和时间分辨率总是相互制约，很难同时提升。常规的解决方案包括提升相机的光子探测效率、优化荧光分子结构或添加除氧剂、三线态淬灭剂等化学方法以提高探针光稳定性。然而，数据驱动的策略仍是一个未充分开发的领域。

2025年1月2日，清华大学生命科学学院陈春来课题组与清华大学自动化系索津莉、戴琼海课题组合作，在《自然通讯》（Nature Communications）杂志发表了题目为“有监督的多帧双通道降噪实现极弱光长时程单分子FRET测量（Supervised multi-frame dual-channel denoising enables long-term single-molecule FRET under extremely low photon budget）”的研究论文，以数据驱动的方式化解成像类单分子FRET观测时长与时间分辨率的矛盾。

本研究提出了一种被称为“多帧双通道融合去噪网络（MUFFLE）” 深度学习的信号重建策略，其结构包括bi-ConvLSTM、U-net CNN和Dual-chanel Residual Fusion模块，充分利用单分子FRET视频数据在时间、空间和光谱层面的冗余信息，通过对视频弱信号进行增强和去噪，实现了在每帧仅需60-70个光子的极弱单分子荧光条件下，进行长时程的单分子FRET测量（图1）。

图1. MUFFLE的网络结构（a）和应用效果（b和c）。

借助MUFFLE的弱信号视频降噪重建能力，研究者首先实现了在衰减激发光功率，单并不影响时间分辨率条件下，将单分子FRET的观测时长拓展至原来的约29倍；此外，研究者还在不影响总观测时长的条件下，将传统TIRF-EMCCD单分子FRET测量的时间分辨率提升了10倍，至3毫秒，进一步逼近了EMCCD相机曝光时间的极限；最后，研究者首次实现了无需除氧剂和三线态淬灭剂的长时程单分子FRET信号观测（视频1），避免了成像中加入的除氧剂和三线态淬灭剂等对生物大分子动力学过程的潜在干扰，为细胞内长时程单分子FRET测量奠定了基础。

视频1. 无需除氧剂和三线态淬灭剂条件下的长时程单分子FRET信号观测。对比了正常激光功率（左），弱激光功率（中）和MUFFLE增强后（右）的单分子荧光图像。上面为Cy3通道，下面为Cy5通道。正常激光功率下Cy5仅持续几帧，阻碍了长时程的测量。

清华大学生命科学学院陈春来副教授与清华大学自动化系索津莉副教授、戴琼海院士为本文共同通讯作者；清华大学生命科学学院已毕业19级博士苗昱与清华大学自动化系22级博士研究生程宇笑为本文共同一作。本项目获得了国家自然科学基金委、北京市自然科学基金重点项目、北京市生物结构前沿研究中心、膜生物学国家重点实验室的经费支持。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-024-54652-w

代码链接：

https://github.com/jarrycyx/MUFFLE

课题组相关论文链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkae604

https://doi.org/10.1038/s41586-024-07486-x

https://doi.org/10.1038/s41586-024-07295-2

https://doi.org/10.1021/jacs.2c12635